En cas de contamination ou de suspicion de contamination par les légionelles ou dans le cadre du suivi de routine, il faut réaliser un prélèvement
d’eau pour analyse de légionelles.
Procédure de prélèvement
Un protocole explicitant le choix des points de prélèvements doit avoir été préalablement mis en place. Il est fortement recommandé de faire appel
à un laboratoire d’analyse réalisant aussi le prélèvement. En effet, maîtriser l’ensemble des paramètres d’échantillonnage (heure, date, produit
neutralisant le biocide dans le flacon d’échantillonnage, modalités techniques, transport du prélèvement…) est indispensable pour pouvoir interpréter
correctement les résultats d’analyse.
L’installation ne devra pas avoir subi de choc biocide dans les 48 heures précédant le prélèvement.
Le technicien prélevant l’eau à analyser doit suivre un ensemble de règles très précises décrites dans le guide des bonnes pratiques Legionella et
tours aéroréfrigérantes ( référence n° [8] ).
Méthodes d’analyse
Pour l’analyse de l’échantillon prélevé, il est recommandé de contacter un laboratoire répondant au minimum à deux critères:
rechercher et dénombrer les légionelles selon une méthode d’analyse normalisée, telle la norme AFNOR T 90–431,
participer à un réseau d’intercalibration conformément à la norme ISO 43 pour les analyses de laboratoire.
Le site http://languedoc-roussillon.sante.gouv.fr propose une liste non-exhaustive rassemblant des laboratoires remplissant au minimum les deux conditions précitées.
Plusieurs catégories de laboratoire répondent en plus à d’autres paramètres de qualité:
les laboratoires qui réalisent les analyses de légionelles et qui sont agréés par le ministère de la Santé pour le contrôle sanitaire des eaux
destinées à la consommation humaine,
les laboratoires agréés par le ministère de la Santé pour les eaux minérales,
les laboratoires accrédités par le CO.FR.AC. pour le paramètre Legionella (programme 100.2), ou par tout autre organisme européen
équivalent signataire de l’accord multilatéral European cooperation for Accreditation (EA).
Il existe d’autres méthodes de recherche et de dénombrement des légionelles dans l’eau:
la méthode par PCR temps réel
la méthode par hybridation in situ (méthode F.I.S.H.)
l’immunologie couplée à la cytométrie en phase solide
La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), actuellement en cours de normalisation à l’AFNOR, consiste à quantifier les Legionella au moyen d’un
message de fluorescence émis par leur ADN. Cette technologie, utilisée auparavant dans les domaines médical et agroalimentaire, permet d’obtenir
des résultats en moins de 48 heures. La présence d’agents inhibiteurs, le manque d’information concernant la viabilité des cellules et la faible
sensibilité de la méthode limite néanmoins son utilisation.
La méthode d’hybridation in situ couplée à la microscopie à épifluorescence permet de détecter et de quantifier les Legionella, à l’aide de sondes
oligonucléotidiques fluorescentes. Elle consiste à localiser une séquence cible de l’ARN ribosomal au sein de la cellule par association avec une sonde
de séquence complémentaire. La limite de détection est liée à la quantité de cibles et donc au pool d’ARNr présent dans la cellule (104 – 105 pour
une cellule à croissance rapide). Il s’agit d’une technique relativement récente, dont la sensibilité et la rapidité en font un outil très intéressant pour
évaluer les niveaux de contamination.
La cytométrie en phase solide constitue une alternative intéressante pour le dénombrement des Legionella. Couplée à une méthode de marquage
immunologique à l’aide d’anticorps mono- ou polyclonaux, elle permet un screening rapide et sensible de la contamination des réseaux d’eau.
Malheureusement, le coût élevé lié à l’appareillage et les risques de réactions croisées en font une méthode encore marginale.
La méthode normalisée par mise en culture reste la seule méthode réglementaire à l’heure actuelle, mais les méthodes de biologie moléculaire,
notamment l’hybridation in situ, apparaissent comme un complément utile aux analyses réglementaires et un moyen de suivi approprié.
Les résultats de ces analyses, ainsi que la méthode employée et les coordonnées des différents intervenants (prélèvements, analyses) seront
consignées dans le carnet de suivi sanitaire de l’installation.
Procédure de prélèvement
Toute analyse réalisée selon une méthode d’analyse normalisée, telle la norme NF T 90-431, mettant en évidence une concentration en légionelles
supérieure à 1000 UFC/litre (Unités Formant Colonies) doit conduire à la mise en œuvre de mesures de désinfection et à une surveillance accrue
de l’installation. Au bout de 3 analyses consécutives indiquant des concentrations supérieures à 1000 UFC/litre, l’exploitant doit réaliser une analyse
méthodique des causes possibles de développement des bactéries Legionella dans l’installation.
Toute analyse réalisée selon une méthode d’analyse normalisée, telle la norme NF T 90-431, mettant en évidence une concentration en légionelles
supérieure à 100 000 UFC/litre (Unités Formant Colonies) doit conduire à l’arrêt immédiat de l’installation et à la mise en œuvre d’une procédure
de décontamination.
Ces exigences réglementaires, en place au niveau national depuis 1999, sont en cours de révision (publication annoncée pour juillet 2004). De même,
un renforcement des règles est en cours pour la région Languedoc- Roussillon en attendant les futures règles nationales, l’inspection des installations
classées ayant pour objectif d’aborder l’été 2004 avec une prévention et un suivi des installations renforcés.
Des informations sur ces évolutions peuvent être obtenues sur les sites Internet du MEDD et de la DRIRE-LR.
